Simulation und Anwendung von DEBRIS zur Ereignisklassifizierung in Einzelmolekül-Experimenten
Simulation kurzer Fragmente zur Schulung in der Einzelmolekül-FLEHT
Die Simulation von kurzen Fragmenten spielt eine entscheidende Rolle in der Schulung von Modellen zur Analyse von Einzelmolekül-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). In diesem Beitrag erläutern wir sieben Kategorien zweikanaliger Intensitäts-Zeit-Spuren, die kürzlich simuliert wurden, um lokale Merkmale zu imitieren, die häufig in Einzelmolekül-Experimenten beobachtet werden.
Kategorisierung der simulierten Daten
Die sieben Kategorien umfassen:
- FRET
- Donor verschwinden (Ddis)
- Donor erscheinen (Dapp)
- Akzeptor verschwinden (Adis)
- Akzeptor erscheinen (Aapp)
- Non-FRET
- Junk
Die Intensität ist in den Kategorien ohne Signal auf 0 gesetzt, mit einem Gaussian-Rauschpegel von Standardabweichung 0,1. Bei Fluoreszenzsignalen sind die Intensitäten in den Donor- und Akzeptorkanälen auf 1 gesetzt, jeweils mit Gaussian-Rauschen (Standardabweichung von 0,125). Junk-Spuren wurden durch Drifts und plötzliche Signaländerungen simuliert.
Netzwerktraining mit Deep Learning
Das zugrunde liegende neuronale Netzwerk wurde mithilfe des DeepNetworkDesigner-Toolbox in MATLAB (2022b) erstellt und trainiert. Es besteht aus drei eindimensionalen Faltungsschichten, gefolgt von biRNNs (bidirectional Long Short-Term Memory). Mit insgesamt 4 Millionen simulierten Fragmenten und einer Vielzahl von Hyperparametern wurde ein robustes und anpassungsfähiges Lernmodell, DEBRIS (Deep Learning for Analyzing Biophysical Signals), entwickelt.
Anwendung des DEBRIS-Systems zur Ereigniserkennung
DEBRIS klassifiziert kurze Fragmente von jeweils 10 aufeinanderfolgenden Frames. Durch die Verarbeitung von zwei- und einfarbigen Intensitätsz trace werden die Muster in vordefinierte Kategorien umgesetzt. Diese Flexibilität macht DEBRIS zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Identifizierung von Einzelmolekülereignissen.
Benutzerdefinierte Kriterien für die Klassifizierung
DEBRIS verwendet einen Gamma-Faktor, um die Empfindlichkeit zwischen verschiedenen Detektionskanälen auszugleichen. Benutzerdefinierte Kriterien helfen dabei, gewünschte Ereignisse zu identifizieren, wobei nicht konforme Spuren als „abgelehnt“ gekennzeichnet werden. Die Schwellenwerte für verschiedene Merkmale und Ereignisse sind dabei entscheidend.
DNA-Markierung und Probevorbereitung
Die Synthese und Reinigung einzelsträngiger DNAs (ssDNAs) sowie die Vorbereitung von Holliday Junction-Proben dienen als Grundlage für präzise Einzelmolekülanalysen. Die Beschichtung von Mikroskopfolien und das Design von Versuchsprotokollen sind wesentliche Schritte, um spezifische Bindung von biomolekularen Proben zu gewährleisten.
Einzelmolekülmessungen
Mit einem maßgeschneiderten TIRF-Mikroskop wurden Einzelmolekül-FLU- und FRET-Messungen in kontrollierten Bedingungen durchgeführt. Diese Messungen ermöglichen das Erfassen dynamischer struktureller Veränderungen in biologischen Molekülen und Komplexen.
Datenanalyse und Reproduzierbarkeit
Die Auswertung der erfassten Daten erfolgt durch speziell entwickelte Software, die eine detaillierte Analyse der Fluoreszenzintensitäten ermöglicht. Statistische Analysen zur Überprüfung der Datenkonsistenz bestätigen die Validität der Ergebnisse.
Fazit
Die Simulation und Analyse von kurzen Fragmenten sind grundlegend für das Verständnis von biophysikalischen Prozessen auf Einzelmolekülebene. Mit Plattformen wie DEBRIS und den multikategorialen Ansätzen wird die FRET-Technologie für die biomedizinische Forschung zugänglicher und effektiver. Weitere Informationen und detaillierte Ergebnisse können in der Publikation gefunden werden.
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