Für passive Permeabilitätsbestimmungen wurden 96-Well-Platten durchlässige Einsätze mit Madin-Darby-Kaninchen-Nieren (MDCK)-Zellen platziert und für drei Tage kultiviert. Der Testartikel in Dimethylsulfoxid (DMSO) Vorratslösung (10 mM) wurde zu Hanks ausbalancierter Salzlösung (HBSS) gegeben, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erreichen. Das HBSS-Puffer enthielt 0,02% Rinder Serumalbumin (BSA) und 10 mM HEPES. Die Akzeptorkammer bestand aus HBSS mit 5% BSA und 10 mM HEPES. Der Test wurde 120 Minuten lang durchgeführt, wobei die Donorkonzentration zum Zeitpunkt null und nach 120 Minuten die Donor- und Akzeptorkonzentrationen bestimmt wurden. Der Unterschied zwischen Version 1 (v1) und Version 2 (v2) der Tests bestand in der Zugabe von BSA36.
Zur Bestimmung der Zytokinchlearheit in Lebermikrosomen wurden mikrosomale Inkubationen in 384-Well-PCR-Platten bei 37°C durchgeführt. Die Testartikel wurden in reiner DMSO-Lösung mit einer Konzentration von 10 mM dosiert und in 25 µL 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 2 mM NADPH gegeben. Diese Lösung (12,5 µL, 10 Minuten lang bei 37°C equilibriert) wurde zu 12,5 µL Lebermikrosomen (1 mg/mL) suspendiert in 100 mM Phosphatpuffer gegeben. Die Reaktionen wurden bei 0,5, 5, 15 und 30 Minuten beendet, indem 10 µL Acetonitril/Ammoniumformiat (93:7) mit den analytischen internen Standards (1 µM Alprenolol und 1 µM Warfarin) hinzugefügt und in eine neue 384-Well-Platte überführt wurden. Die gestoppten Inkubationen wurden bei 5000 x g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und die Überstand wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektometrie (LC-MS) analysiert, um den Prozentsatz des verbleibenden Testartikels relativ zu Zeit Null zu messen und die in vitro Eliminationsratekonstante (kmic) zu bestimmen. Die intrinsische Clearance (CLint) wurde berechnet, indem kmic durch die Konzentration an mikrosomalem Protein geteilt wurde.
Die Plasma-Proteinbindungswerte wurden hauptsächlich durch Gleichgewichtsdialyse bestimmt. Die Bindung an Proteine wurde unter Verwendung eines schnellen Gleichgewichtsdialysegeräts (RED-Gerät von ThermoFisher) gemessen. Testartikel wurden in Matrix (Plasma, humane Lebermikrosomen oder Hirngewebe) gelöst. 300 µL der Matrixlösungen wurden in die rote Kammer eines RED-Geräts gegeben und 500 µL 100 mM Phosphatpuffer in die weiße Kammer. Das RED-Gerät wurde mit einer gasdurchlässigen Membran abgedichtet und für 4 Stunden bei 37°C unter 5% CO2 auf einem Schüttler (750 U/min) inkubiert. 50 µL Proben aus beiden Kammern wurden in 600 µL Acetonitril überführt, das den analytischen internen Standard (0,2 µM Glyburid) und 50 µL Puffer oder Matrix für einen Matrixabgleich enthielt. Die Proben wurden bei 5000 x g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde mittels LC-MS-Analyse analysiert, um Testartikel und internen Standard zu messen. Der freie Anteil (fu) wurde berechnet, indem das Flächenverhältnis der Empfängerkammer durch das Flächenverhältnis der Donorkammer geteilt wurde. Für Verbindungen mit hoher Molmasse wurde die PPB mittels Ultrazentrifugation gemessen. Testartikel (5 µM) wurden zu 1000 µL Plasma gegeben und für 10 Minuten bei 37°C in einem Glasgefäß inkubiert. Zum Nachweis der Gesamtkonzentration wurden 3-mal 50 µL zu einer 96-Deep-Well-Platte vorgefüllt mit 600 µL Acetonitril/Wasser (9/1) hinzugefügt, das den analytischen internen Standard (0,2 µM Glyburid) und 50 µL Phosphatpuffer enthielt. Für den freien Anteil wurde ein Aliquot von 700 µL bei 436.000 x g für 5 Stunden bei 37°C zentrifugiert. Am Ende der Zentrifugation wurden 3-mal 50 µL des Überstands vorsichtig entnommen und zu der 96-Deep-Well-Platte mit Acetonitril und dem internen Standard hinzugefügt. Die Platte wurde für 10 Minuten bei 300 U/min geschüttelt und über Nacht bei -20°C gelagert, um die Proteinausfällung zu erleichtern. Am nächsten Tag wurde die 96-Deep-Well-Platte bei 4500 U/min für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand (50 µL) wurde in eine 384-Well-Platte mit 30 µL Wasser überführt. Die Proben wurden mittels LC-MS analysiert, um Testartikel und internen Standard zu messen. Die Modellierung und die Evaluierung von ADME-Daten auf der Grundlage von 25 Tests wurden durchgeführt. Diese Daten wurden aggregiert, wenn mehrere Messungen für denselben Verbindungs- und Testendpunkt vorlagen. Werte außerhalb des dynamischen Bereichs der Tests wurden ausgeschlossen und qualifizierte Werte wurden bei Permeabilität, PPB, LogP und LogD verworfen. Die PPB-Werte wurden in freie Fraktionen (fu) umgerechnet und IC50-Werte aus CYP-reversiblen Hemmungstests wurden mit einer negativen logarithmischen Transformation in pIC50 umgewandelt. Die logarithmischen Transformationen wurden auf die anderen Testendpunkte angewendet, außer auf LogP und LogD. Alle oben genannten Tests wurden für das Training von Modellen genutzt, aber nur ein Teil von ihnen wurde aufgrund der Datenverfügbarkeit für die Modellbewertung verwendet. Einige Tests werden seltener angefordert oder wurden zugunsten einer neuen Version oder anderer Technologien veraltet. Datenbankstatistiken werden unten diskutiert und berichtet. Vier Multi-Task-Graph-Neural-Networks (MT-GNN) wurden zur Vorhersage von Permeabilität, Clearance, Bindung/Lipophilie und CYP-Inhibition entwickelt und bewertet. Die Modelle wurden als Ensembles eines Message-Passing-Neural-Networks (MPNN) und eines Feed-Forward-Deep-Neural-Networks generiert. Die Modelle wurden mit verschiedenen Prozessen und Akzeptanzkriterien zur Gewährleistung der bestmöglichen Datenqualität trainiert. Verschiedene Leistungsindikatoren wie mittlerer absoluter Fehler (MAE) und durchschnittliche Genauigkeit wurden verwendet, um die Leistung der Modelle zu bewerten. Nachfolgend folgten Modellverfeinerungen und die Anwendung von Transfer Learning zur Verfeinerung der Vorhersagen für spezifische Themen. Eine große Menge an Daten und Proben wurde verwendet, um diese Methoden zu validieren und zu bewerten.